一位新冠患者的确诊之路：多次核酸阴性的隐忧

为了提高核酸检测的检出率，近期一些省市增加了肛拭子检测。这样的做法究竟是否能够提高检出率？

第一财经记者对一些多次核酸检测阴性病例进行了分析，发现并非如此。检出率是与核酸诊断试剂灵敏性紧密相关。

确诊病例曾多次核酸阴性

1月24日，河北省卫健委公布了23日确诊的17个病例轨迹，其中病例15确诊历程有点曲折。

河北藁城区的疫情始于1月2日的一例确诊病例。这引发了以藁城区增村镇小果庄村为核心的周边村庄的疫情。而23日确诊的病例15，就是距离小果庄村2公里的刘家佐村的一位村民。

根据官方公布的轨迹，确诊病例15：男，57岁，藁城区增村镇刘家佐村人，为1月6日第25号确诊病例的丈夫。2020年12月27日至31日居村无外出；2021年1月1日骑电动车至增村镇小果庄村水产特卖商店购物；1月2日至1月9日居村无外出，期间3日、4日、5日、8日4次核酸检测均为阴性；1月10日转运至藁城区指定隔离点进行集中隔离医学观察，当日核酸检测呈阴性；1月11日因发热转运至晋州市人民医院发热门诊，直至1月21日均在发热门诊隔离病房进行治疗，期间8次核酸检测均为阴性；1月22日核酸检测呈阳性，由120负压救护车转运至石家庄市人民医院建华院区，1月23日诊断为确诊病例。

病例15在1月11日前做了4次核酸，皆为阴性。根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》所描述的临床症状，潜伏期 1～14 天，多为 3～7 天。那么，在1月11日前出现的核酸阴性，按照病程进展，可能不会引发更多的人注意。这可以理解为，在病毒复制载量不够高时，尚无法被检测出。

但值得注意的是，1月11日，病例15已出现发热症状，即已经到了临床症状出现的时候。在11日-21日发病期间，患者进行了8次核酸检测，结果皆为阴性，直到1月22日核酸检测为阳性。

多次核酸检测为阴性，在石家庄的核酸筛查中不少见。

第一财经记者不完全统计发现，在石家庄市1月15日~21日确诊的222例病例中，一次核酸检测就发现阳性的比例占14.4%（32个病例），其余190个确诊病例的核酸检测次数为2~10次，最为常见的是3~4次。1月20日确诊的一病例，第10次核酸检测后确诊。核酸检测从1月3日持续到1月20日，时间跨度达17天。

当前新冠疫情的传染源主要是确诊患者和无症状感染者，而在潜伏期即有传染性是突出特点。如果不能在第一时间发现它的存在，就给病毒进一步传播带来机会，特别是在防控全靠一纸核酸诊断报告的情况下，早一天发现感染者成为关键。

在排除病毒窗口期或者说潜隐期的时间段1-7天内，核酸诊断试剂不能检出的时间超过8天以上，并多次核酸阴性的现象值得究其原因。

病例15的检测过程

石家庄市病例15的实际检测过程是怎样的呢？

据第一财经调查，1月11日患者因发热转运至某医院。该医院使用某核酸检测试剂，检测结果为阴性，这种连续阴性持续到18日上午。

由于病例15已经出现了临床症状，对于这种核酸持续阴性，医院只好使用其他核酸诊断试剂进行差别检验。

18日下午，该医院对该患者，使用两种核酸诊断试剂进行差别检测。

先是使用S企业配套采样管取样，核酸检测为阳性，该样本复测也是阳性，扩增曲线标准，dt值正常。之后，用该医院之前采购的某企业A核酸诊断试剂的配套采样管对同一个样本取样，用该企业的快检方法（不提取）和普通方法（磁珠提取）检测都是阴性。同时还取了一个样本送中医院，用RT-PCR双靶试剂再检测，依然是阴性。根据目前国家的指南要求，因为RT-PCR试剂检测为阴性，所以当天没有报告阳性病例。

为了报告的准确性，1月22日，该院再次对该患者使用S企业保存液取样，检测为阳性，该样本复测也是阳性，扩增曲线标准，dt值正常。22日，同样用A企业核酸诊断试剂也取样检测了，快检和普通方法都是阴性。不过，该院为了进一步求证，对该患者进行了抗体检测。结果是：抗体阳性。

中国疾控中心研究员李中杰等发表在《中华流行病学》杂志上的文章《新型冠状病毒感染者特异性抗体动态变化特征》称，多项研究发现，部分新冠病毒感染者（含确诊病例和无症状感染者）在发病后（或首次核酸检测阳性后）1周内就可以检测到特异性IgM抗体，阳性率约为11.1%~50.0%；发病后第2周，特异性IgM抗体水平上升达到或接近峰值状态，阳性率增加至59.7%~86.7%。

由此可见，虽然A企业核酸诊断试剂的检测结果为阴性，但抗体阳性证明此患者已感染新冠病毒，且处于发病一周后。

为何出现假阴性

对于上述案例，很多人会自然将之归为核酸诊断试剂的假阴性。但这个“假”，超越了“假阴性”的定义，特别是在已发病的患者身上。

目前，核酸检测是确诊新冠肺炎的“金标准”，只有通过核酸检测阳性才能确诊。但“假阴性”一直存在，并且导致假阴性的原因也很多，比如检测试剂盒性能；标本未采集到含有病毒的细胞；采样部位与病期不一致；核酸提取的效率与纯度，体外诊断试剂灵敏度差异；病毒变异性；规范的临床实验室等。每个环节都会影响最终的检测结果。

上述假阴性，究竟是操作层面的问题还是试剂本身的问题所致？第一财经记者采访了核酸诊断试剂领域的专家，对不同的核酸诊断试剂进行了分析。

“单纯就这个病例检测过程看，总共采了十多次样本，每次采样都是单靶试剂阳性而PCR双靶试剂阴性，不太可能每次采样都出问题。也就是说，可以排除样本采集和处理环节操作不规范导致假阴性的因素。由此，问题在于核酸诊断试剂本身。”这位专家分析称。

上述专家表示，此案例中两个试剂的不同之处在于，S企业是单靶点试剂，检测下限为250拷贝/mL，试剂盒内完整的包括了提取和扩增试剂；A企业不论是快检还是普通试剂都是双靶标试剂，检测下限500拷贝/mL。前者试剂的灵敏度比后者高，所以同时出现了一个阳性而另一个阴性的结果。

从试剂研发机理来说，检测靶标越多，所需引物探针数量越多，相互干扰越严重，灵敏度越低。因此，检测靶标越多，漏检的可能性反而越大。该案例/临床数据都证明了这点。“这可能是此案例多次核酸阴性的核心因素所在。”上述专家表示。

关于核酸诊断试剂灵敏问题

虽然细节不完全相同，但上述类型的“假阴性”也在其他地方发生过。

核酸诊断试剂分为单靶点和双靶点产品。

在《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第二版）》中要求双靶标检测结果同时为阳性方能确认病例为阳性，由此带来了临床使用环节的尴尬，唯双靶标检测试剂为风向标，忽略检测试剂的灵敏性。

国家卫健委临床检验中心和FIND（世卫组织创新诊断基金会）曾经的评价结果显示：单靶标试剂和双靶标试剂性能相比，具有更高灵敏度（平均ct值最小，可理解为更快确认阳性）；单靶标试剂对阳性样本的检出率要高于双靶标试剂。

在临床应用环节，第一财经的调研发现，有关新冠核酸诊断试剂招采的信息中发现，有些省份医保物价明确写明双靶试剂，导致单靶试剂无法使用；有地方疾控中心的内部文件要求不能用单靶。还有些省份，虽然没有官方文件，各地医疗机构尽管在发热门诊、急诊等有需求，但核酸检测限定在RT-PCR和双靶上，医院相关领导也不想承担额外的风险。

“不管单双靶，重要的是核酸诊断试剂的灵敏性要高，不能只因为政策文件而掣肘临床的应用。”前述专家表示。

关于核酸诊断试剂灵敏问题，国家相关部门已经发出了通知。

2020年12月28日，国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组印发了《关于印发医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行 第二版）的通知》（下称《通知》）。《通知》要求，对集中隔离人员，要通过鼻咽拭子采集上呼吸道标本，并选择高灵敏（检测限≤500拷贝/ml）的试剂。同时要求，“原则上，提取试剂、提取仪、扩增试剂和扩增仪应当配套使用，并在检测前进行性能验证”。

“不得不说，带来假阴性的一个原因还有提取试剂、提取仪、扩增试剂和扩增仪不兼容。由于最低价采购，很多地方采集的这些产品来自不同的厂家，对检测结果也有影响。”前述专家表示。

提高核酸诊断试剂灵敏性问题，成为当前急需要解决的工作。